La méthylation de l'ADN est l'une des modifications les plus importantes dans des cellules de mammifère qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la croissance des cellules et leur prolifération. Chez l'homme, il se réfère à l'ajout d'un groupe méthyle à la position 5 de la cytosine-carbone (5-méthylcytosine ou 5 mC), qui se trouve exclusivement sur les sites de CG symétriques sur la double hélice d'ADN - également appelé dinucléotides CpG.
La détection de schémas de méthylation de l'ADN est un domaine de recherche progresse rapidement, avec la possibilité de promesses le profilage de la méthylation de distinguer différents types de tumeurs et cancers, et, éventuellement, leur réponse à des agents chimiothérapeutiques. Détection des aberrations de méthylation de l'ADN semble être l'un des tests les plus importants dans le diagnostic précoce du cancer.
De nombreuses techniques mises au point pour la détection de méthylation de l'ADN peuvent être divisés en trois groupes: modification chimique avec du bisulfite (représenté par le séquençage génomique au bisulfite), l'enzyme de restriction digestion (représenté par des endonucléases de restriction sensibles à la méthylation) et de l'isolement par affinité de l'ADN méthyle (représenté par immunoprécipitation de l'ADN méthylé).
Le séquençage génomique au bisulfite
La technologie de séquençage génomique au bisulfite est considérée comme un étalon-or dans le domaine de la détection de méthylation de l'ADN en raison de son approche quantitative, qualitative et efficace pour identifier la 5-méthylcytosine à seule résolution paires de bases. Cette technique permet la différenciation de l'ADN non méthyle de méthyle par l'intermédiaire d'une amplification par PCR et l'analyse subséquente des produits de la PCR.
La PCR est une méthode utilisée pour amplifier des sections choisies de l'ADN pour analyse. Au cours de l'amplification par PCR dans le séquençage génomique au bisulfite, les cytosines non méthylées comme amplifient la thymine, tandis que les cytosines méthylées comme amplifient la cytosine. L'état de méthylation peut être ensuite déterminé soit par séquençage direct du produit de PCR (où l'état moyen de méthylation est détecté) ou le séquençage de sous-clonage (lorsque la distribution de molécules simples modèles de méthylation est détectée).
La plupart des méthodes d'analyse de méthylation de l'ADN au locus spécifique d'intérêt sont basés sur cette approche. Techniques éminents qui travaillent sur la base de bisulfite sont combinés Restriction bisulfite Analyse (COBRA), méthylation PCR spécifique (MSP) et sensible à la méthylation Single Nucleotide extension d'amorce (Ms-SNuPE). De nombreuses modifications de bisulfite protocole de séquençage génomique ont été explorées pour optimiser le résultat final et améliorer la précision d'ensemble de cette procédure.
Endonucléases de restriction sensibles à la méthylation
Les endonucléases de restriction sensibles à la méthylation représentent des outils classiques d'analyse de méthylation d'ADN. Méthodes qui les emploient soit pour enrichir l'ADN méthylé ou non méthylé ADN. La capacité d'enrichir ADN non méthyle - par digestion de l'ADN méthylé ou en isolant des fragments plus petits générés par des enzymes de méthylation inhibé - est particulièrement utile pour l'analyse des génomes importantes, fortement méthylées.
Les enzymes de restriction les plus souvent utilisés sont les couples d'enzymes de restriction (également appelés isoschizomères) Hpall et MspI, qui reconnaissent l'CCGG de séquence. Hpall est bloqué par la méthylation de l'une des deux cytosines, alors queMspI est bloquée par méthylation de se contenter de la cytosine extérieur. Dans les génomes de mammifères, où la méthylation est liée presque exclusivement à des sites CG, HpaII est inhibée et MspI n’est pas.
Plus de 60% des sites CG sont méthylés dans le génome humain, et donc l'enrichissement de l'ADN non méthyle réduit une complexité de l'échantillon de manière significative. La procédure elle-même semble être plus simple et plus rapide que le séquençage génomique au bisulfite. La limitation importante partagée par toutes les techniques basées sur des endonucléases de restriction sensibles à la méthylation est l'analyse de méthylation que dans les sites de reconnaissance.
Immunoprécipitation d'ADN méthylé
L’immunoprécipitation de l'ADN méthylé (MeDIP) est une technique efficace pour l'extraction de l'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'intérêt. Dans cette procédure, l'ADN génomique est traité par ultrasons en fragments et immunoprécipité avec des anticorps monoclonaux (anticorps produits par un seul clone de cellules) qui reconnaissent spécifiquement 5-méthylcytidine.
ADN méthyle lié au complexe anticorps est ensuite séparé du reste de l'ADN par un aimant utilisé pour tirer les complexes sur une solution. Après l'isolement et la purification est réalisée, l'ADN méthylé est prêt à recevoir n'importe quel locus spécifique (PCR) ou l'ensemble du génome (séquençage et microarray) études de méthylation. La technique fournit une vue rapide de niveaux de méthylation d'ADN avec seulement une quantité limitée d'ADN de départ.
Bien que MeDIP est plus rapide que les méthodes de séquençage au bisulfite traditionnels et non limité à l'analyse de séquences spécifiques comme dans l'analyse des enzymes de restriction, l'immunoprécipitation dépend de la séquence d'ADN (y compris la densité en CpG), la présence d'éléments répétitifs et la composition. Ainsi, des contrôles appropriés sont nécessaires pour l'analyse et l'interprétation des résultats obtenus.
